根据官方通报的数据,新型冠状病毒肺炎(NCP)目前仍然有大量疑似病例尚未确诊。而与此相对应的另一组数据显示,截至2月1日全国范围内病毒核酸检测试剂盒日产量可达77.3万份。理论上的“基本满足检测需求”,与实际情况的出入令人困惑。

同时,全国范围内还出现了多次经核酸检测试剂盒检测为阴性、但最终证实为阳性的病例,一时间外界又对核酸检测试剂盒的可靠性产生了疑虑。

“强烈推荐CT影像作为目前新冠肺炎首选诊断方法”,武汉大学中南医院医学影像科副主任张笑春教授曾在朋友圈留言,“病毒核酸检测是最终确诊NCP无创诊断的金标准,然而‘CT阳性、核酸阴性’的检测结果,可能会影响临床排查。目前核酸检测特异性高、敏感性偏低,不排除存在部分假阴性。”

随后2月5日更新的NCP诊疗方案(试行第五版)中,“疑似病例具有肺炎CT影像学特征者”首次列为湖北省临床诊断病例标准。

这些都让我们对核酸检测试剂产生好奇。它的原理是什么?影响病毒检测的因素有哪些?目前NCP疑似病例确诊的方法包含哪些?病毒核酸检测试剂盒究竟靠不靠谱?

病毒核酸检测原理简析

在自然界中,病毒主要分为两大类,RNA病毒和DNA病毒,新型冠状病毒(2019-nCoV)属于前者。

RNA病毒在传播过程中拥有自我复制和逆转录两种复制方式。由于在其复制过程中,用于错误修复机制的酶的活性很低,因此其变异很快。但疫苗的研制却需要根据病毒的固定基因或蛋白进行,这也是当年SARS疫苗迟迟未研发成功的重要原因。

幸运的是,至少到目前新型冠状病毒尚未发生变异,并且已经第一时间检测出病毒基因序列,这将加速当下疫苗的研发进度。同时,由于普通RNA病毒对外部环境的抵抗力普遍比DNA病毒弱,因此治愈起来更为容易。当然也有例外,比如逆转录病毒——艾滋病病毒(HIV)的治愈就极其困难。

那么RNA病毒感染人体后如何进行检测呢?目前常见的RNA病毒检测方法是基于逆转录PCR技术(RT-PCR)实现的,这也是目前主要NCP核酸检测试剂所使用的“实时荧光定量逆转录PCR法”的基本原理。

简单来说,新型冠状病毒存在有特异性的基因序列,我们利用能够识别这些基因序列的引物探针去做real-time RT-PCR,即实时荧光定量逆转录PCR,它能够放大扩增特定DNA片段,如果反应后有目标基因序列扩充出来,则检测结果判断为阳性,即存在病毒。当然,这其中会出现误差,后文会具体解释。

据了解,目前疑似病例提取样本检测主要包含采集、灭活、核酸提取、PCR扩增、试剂反应等多个环节,检测过程环节多,风险高。样本运输需要过程,而样本的信息录入也需要很大的工作量,反应敏度控制也会影响检测时长。

一般而言,一例病毒样本送达实验室后需要4到6小时才能获得检测结果,其中核酸提取时间约为七八十分钟,而PCR扩增反应则需要一个半小时。

检测过程复杂、运输过程耗时、以及符合条件的实验室稀缺,诸多因素是导致目前病毒核酸检测试剂盒产量充足、却无法完全实现全部疑似病例检测的重要原因。不过,从目前来看,这一状况正在逐渐得到改善,确诊病例的明显增长便是重要佐证。

“确诊病例出现明显增长首先是因为检测能力的提升,越来越多符合条件的实验室加入到检测机构行列中。同时,早期开展检测的实验室也通过多种方法扩大检测能力”,武汉华中科大同济医院分子诊断与遗传学实验室孙自镛主任在接受央视记者采访时表示。目前,华中科大同济医院每日核酸检测能力是1000到1200例新型冠状病毒样本。

为了加快疑似病例的确认工作,包括华中科大同济医院分子诊断与遗传学实验室在内的诸多病毒检测实验室均实行“换人不换岗”的制度,24小时联动进行病毒检测。

在2月7日召开的湖北省第十七场疫情防控例行发布会上,武汉市委常委、常务副市长胡亚波表示,目前武汉市可开展核酸检测的机构已扩展至35家,每天的检测能力从200份增加到了6000-8000份,并将继续努力提升检测能力。

病毒核酸检测不是“万能”的

2月8日上午,“出现咽拭子核酸检测三阴感染者”话题登上微博热搜,而此前也有诸多患者在经过多达四次病毒核酸检测才最终确诊,这令我们对“狡猾”的病毒有了新的担忧——病毒核酸检测试剂盒究竟靠不靠谱。

“一般而言,核酸检测是目前最准确的诊断方法”,一位行业专家告诉PingWest品玩,“目前核酸检测出现假阴性患者主要包含两方面原因,一是采样时没有采集到病毒,二是核酸检测试剂盒的灵敏度(真阳性率,即准确检测出相应病人的概率)不高造成的。

病毒没有采集到容易理解,比如在咽拭子采样过程中,由于病人比较难受导致采样深度不够,从而无法采集到有病毒的样本,又或者是患者为轻症患者或者是初期感染者,RNA病毒尚未“出现”在咽部,亦或是“敏感度”较低。

对此,国家医疗专家组成员、北京地坛医院感染性疾病诊疗与研究中心首席专家李兴旺曾在2月4日的国家卫健委发布会上表示,“目前核酸检测的方法还是比较敏感的,有很多影响因素,比如采取标本的规范化程度、时间、检测手段等问题,这也是目前没有把核酸检测放开去做的重要原因。”

同时,李兴旺也提示医生和护士要规范地采集标本。李兴旺认为,从呼吸道标准来讲,肺泡灌洗液对于试剂盒的敏感性要高于痰的结果,痰的敏感度又要高于咽部的,所以越是危重病人诊断率越高,这是因为能采到肺泡灌洗液。接下来,更好的办法是普通病人更多用痰做检测,这样可能会把阳性率进一步提高。

其次,核酸检测试剂盒的灵敏度也会影响检测结果。据相关媒体报道,当前市场上有96家企业相继推出病毒核酸检测试剂盒,然而截至目前,仅有7款产品获得国家药监局应急审批,其中6款采用实时荧光定量逆转录PCR法。

“影响试剂盒精确度的因素太多,光是检测靶点,被世界卫生组织推荐的就有6套,即便使用同一套检测靶点,也会因试剂盒的成分组成差异导致生化反应存在细微差别,此外,酶、离子用量和溶液、底物浓度配比都会影响试剂盒的灵敏度,这也是对厂家技术实力的考验”,中科院半导体研究所研究员任鲁风曾经告诉《商学院》记者。

“目前国内对试剂盒的评价标准主要是通过临床对比实验来看检测效果,就新型冠状病毒而言,只有阴性阳性符合性标准,并无试剂原料质量标准,配方也只规定了组成成分,并不规定具体比例,公开标准也均是推荐性,而非强制性,因为这些标准其实并无必要去统一,这更多是技术问题,也是市场机制下优胜劣汰的一部分”,任鲁风补充道。

除了假阴性,还存在与之对应的“假阳性”。这背后的主要原因是由于样本或者核酸检测试剂盒被污染所致。“样本本身的污染、检测试剂盒的探针引物和酶的污染、运输途中的污染、缺少严格控制条件的实验室环境、以及不专业的检测操作,都会导致假阳性出现”,行业专家对PingWest品玩表示,“这也是确诊病例有核减的原因之一。” 

目前,一些核酸检测试剂盒生产商已经将病毒检测位位点扩增至6到7个基因,同时对序列进行优化设计,相比初期的2个基因位点会更加精准。同时,随着越来越多符合条件的实验室的加入,以及检测标准的不断完善,病毒核酸检测也变得愈加精准。

国家药监局器械注册司稽查专员江德元表示,针对近期国家药监局审批的7家企业的核酸检测产品,相关产品的安全性、有效性和质量可控性可以得到保障。

患者确诊靠的是综合诊断

“任何病毒的核酸检测检出率都不可能是百分之百,对新型冠状病毒的核酸检测也不例外,它检出假阴性也是在所难免,同时检测检出率的结果也和患者本身病情轻重程度、疾病发展的不同阶段、取样采样的方式方法和实验室自身的检测条件等多种因素相关”,北京大学人民医院呼吸内科主任高占成在2月9日国务院联防联控机制新闻发布会上表示。

“对于确诊新冠肺炎,核酸检测是一个不可或缺的手段,要是检测结果为阳性,我们可以确诊为新冠肺炎。如果初次检测结果阴性的属于疑似病例患者,按照卫生健康委现行诊疗方案的要求,需要在定点医院进行隔离治疗,严格观察。”

在2月5日更新的NCP诊疗方案(试行第五版)中,“疑似病例具有肺炎CT影像学特征者”首次作为湖北省临床诊断病例标准。

据了解,由于目前NCP的流行正与流感季重叠,而两个疾病临床表现有非常类似,因此目前很多确诊病例的诊断主要是根据明确的流行病学史。目前,如果患者有明确的流行病学史,加上CT影像表现和核酸检测,一般临床诊断便没有问题。“临床上靠的是综合诊断,而不是靠某一个临床表现”,北京佑安医院感染综合科主任梁连春在接受媒体采访时表示。

此外,目前全国范围内出现了个别无症状感染者,由于其无临床表现,所以只能通过核酸试剂盒进行检测。同时,也有部分患者此前3次肺部CT影像均无问题。

因此,从目前来看,NCP疑似病例确诊仍然以流行病学史和核酸检测结果为主。如果临床表现和肺部CT影像都与NCP非常类似,核酸多次检测均为阴性,该患者也会按照确诊病例来管理。

备注:插图均来自互联网。

毒镜头:老镜头、摄影器材资料库、老镜头样片、摄影