督导回美国度假一周，趁机我摸了会儿鱼，看了一篇今年年初发表在Science上非常有意思的文献（Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior），和大家分享一下。
想了想，目前写的科普文章暂且还是不投稿给其他专栏了。毕竟我写的都不是硬核原创，而是“整合型原创”，在大号上公开发表心里比较发毛，还是再成长一会儿吧。
题图和大家分享前几日的傍晚。We are falling into the night at nightfall.
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我很讨厌运动，但我还是花了钱去办了健身卡。并没有什么帅气的教练小哥唆使我（倒是想碰上），而是我听说过很多“运动令人上瘾”“运动后脑分泌多巴胺”这样的说法，于是抱持着“三次成瘾终身难戒”视死如归的念头签了年卡合同，期待从此可以练出强大的心肺功能，以后周一早上好十分钟不喘气狂跑两公里到学校踩点出席例会。
你猜怎么着？我对健身房欲罢不能、有“一日不去浑身痒”的戒断症状了吗？
文末揭晓答案。
说起“运动成瘾”，我竟从未想过为何运动会给人以快感，为何会刺激奖赏中枢。明明这是一件费时费力无目的消耗能量不利于生存的事。今天看到这篇文章的标题深深吸引了我，让我开始思考小脑在其中所起到的作用：《小脑对奖赏回路及社会行为的调制》（http://science.sciencemag.org/content/363/6424/eaav0581）。我好奇它是如何与奖赏关联，肢体运动本身会有奖赏吗，又怎么与社会行为挂上钩的。
占据大脑近3/4数量神经元的小脑，或许一直在多个领域默默无闻地暴力输出。近几年人们在不少神经疾病如自闭症和精神分裂症中都发现了小脑缺陷。在运动协调方面表现优异的小脑，会在高级认知和情绪中究竟扮演着一种什么样的角色？这个问题已经逐渐引起学术界的关注。
首先来看一下小脑的解剖结构吧。熟悉的可以跳过了。
西点房里的小脑
小脑位于枕叶的下方，脑干的背侧。小脑皮层（cerebellar cortex）由10个小叶组成。大脑有“四叶”，这里的“叶”是lobe，是很大的，而小脑的“叶”很小，英文里用来称呼“小叶”的词是lobule。这十个小叶叠在一起，从前到后依次标为1-10。如果从矢状面切一刀下来，就很容易数清楚了。
从背面来看的话，大致可以把它分成左右两小脑半球（hemisphere）和中间蚓部（vermis）三部分。蚓部和半球之间没有明确的分界线。分得细一点的话，在蚓部和半球之间还有一条旁蚓部（paravermis）。在皮层底下呢，左右两边各有三个小脑核团。过去叫“深部小脑核团（deep cerebellar nuclei，DCN）”，现在只说“小脑核团（cerebellar nuclei）”了。
小脑的立体结构一开始是有点难想象的。不过你可以试着想象一条两头小中间大的切片面包（对不起糕点师傅功夫不到家）。这10片切片面包不是整齐码成一排，而是被拨成了类似扇形的样子。然后糕点师傅还在中间加了蓝莓果酱夹心，你吃到中间的时候才能看到（对不起我真的饿了）。
不过这个切片面包还是做得相当用心。它的外边儿有三层。先说中间的。中间薄薄一层是单层浦肯野细胞层（Purkinje cell layer），是硕大的浦肯野细胞（Purkinje cell，PC）胞体落脚之处。数量不多，发育成熟的小脑内大约有20万PC。它们就像被糕点师傅拿镊子一粒一粒放好在蛋糕上的一列草莓，看着十分安心！
PC向上朝前后开扇，在分子层（molecular layer）形成树冠一样非常漂亮的树突，而轴突向下扎根，穿过颗粒细胞层（granule cell layer），穿过白质，（穿过胞山胞海，）最终到达蓝莓夹心——小脑核团。但是如果你从冠状面去看，是看不到它们的树突扇的，因为它们是“侧身”开扇的，所以你只能从矢状面的切面看到。
与稀为贵的PC层不同，颗粒细胞层里有全脑数量最多的神经元种类，颗粒细胞。别看它小，它们小小的身体里蕴含着巨大能量。其轴突非常厉害，向上穿过PC层，在分子层向两侧分叉形成平行纤维（Parallel fiber，PF），90度垂直穿过PC的树突扇。每一根平行纤维可以与250-750个PC接触，而每个PC可接受大约20万根平行纤维的输入。
（是这样的，之所以把PC比作草莓，把核团神经元比作蓝莓，是因为鄙人喜欢把PC染成红的，把核团显示成蓝的，这里的大小比例不是很对。PC比核团神经元稍大一些，没有草莓和蓝莓这么夸张。另外，实际上鄙人最喜欢吃的浆果是树莓。）
好了，小脑皮层的硬件基本就是这样，深入了解的话，还可以了解一下各层内的中间神经元。
小脑皮层通过两种线路接收所有感觉模式的输入。一是爬行纤维（climbing fibers，CF）。它们从脑干的下橄榄核（Inferior olive，IO）发出，曲折向上到达小脑的PC层，与PC的胞体和树突纠缠在一起。另一则是苔状纤维（mossy fibers，MF）。我们所说的纤维就是指神经元的轴突。那么这是谁的轴突？源头有很多，比如脑干网状核团、脊髓神经核团等，MF只是一个统称。相比于CF，目前我们对MF知道得非常少。它的终点在颗粒细胞层，与颗粒细胞形成玫瑰状小结。由同一核团发出的MF会在小脑皮层中形成看似有规律的玫瑰结分布，但是这个规律还没有被找出来，尚且在mapping阶段。
也就是说，小脑皮层所接收的感觉输入最后都会到达PC。一条路是CF-PC，直接与胞体和树突接触。另一条路是MF-GC-PF-PC树突，不与胞体直接接触。显然，CF输入对PC的影响比较直接，而MF相对弱一些（但是目前还不确定，我们尚且这么说吧）。模糊地说，MF将各种感觉反馈信息传递给PC；捡我知道的说一下，蚓部接收的与肢体位置的本体感觉有关，绒球小结叶和平衡眼动信息有关。而CF编码的是误差信息（error information）。当实际运动的感觉反馈和意图运动指令的模拟反馈不一样时，CF就会叮地电一下PC。
PC作为小脑皮层的唯一输出，其下家是小脑核团（cerebellar nuclei，CN）。过去由于技术不够发达，我们对CN也知道得很少，现在要了解得多一些了。CN由三个亚核团组成，从内侧到外侧分别是：顶核（fastigial nuclei，FN；也有叫中央核的，medial nuclei），间位核（interposed nuclei，IN）和齿状核（dentate nuclei，DN；一开始学的时候还与齿状回混淆了，其实两者在位置上没有一毛钱关系）
蚓部和旁蚓部的PC投射到FN和IN，核团接下来投射到下行运动系统，这部分在功能上归为脊髓小脑（spinocerebellum），因为其与躯体动作的控制和协调有关。绒球小结叶与小脑核团编外成员前庭核（是的它被现在踢开了）被归为前庭小脑（vestibulocerebellum），主要调节躯体平衡和眼球运动。小脑皮层半球部分接收来自大脑皮质的MF输入，投射到齿状核，接下来齿状核的输出通过红核和丘脑抵达大脑皮层运动区域。
这篇文章的故事就是从这里开始的。
我曾在上一篇文章里说到，中枢系统要想精确完成一个动作，不仅需要向下行运动系统发送运动指令，还需要有一份运动指令拷贝，并进行正演（forward）运算，计算出预期感觉反馈，也就是要预测做出一个动作后会从本体感受器收集到怎样的感觉反馈。比对预期感觉反馈和实际感觉反馈后，再进行调节，最终将精确执行预想的动作。
信息预测和比对都是在小脑内完成的。这就赋予了小脑出色的预测外来信息和联想学习的能力。这一点对脑的非运动功能贡献良多。学界现已达成一些共识：小脑参与情绪的知觉、再认和评估，并将其与行为整合；负性情绪对小脑的作用较大，并会影响其在情绪性行为中的预测功能 (Adamaszek et al., 2017)。
在人类神经疾病的研究中，人们通过fMRI成像，在自闭症、精神分裂症和成瘾等非运动系统疾病患者中发现了小脑障碍。实际上，自闭症患者均有小脑障碍。我们知道，自闭症（Autism Spectrum Disorder, ASD）的典型特征是：1）社交缺陷；2）兴趣狭隘、重复性动作；3）沟通功能障碍。现在小脑在疾病中的作用机制还不清楚，研究方向也比较多。这篇文章是从奖赏（reward）入手的，他们猜想小脑对奖赏的关联、加工、知觉和解释有影响，而疾病扰乱了这一功能，从而出现社会行为障碍。
说起奖赏，起重要作用的脑区是腹侧被盖区（Ventral Tagmental Area，VTA）。VTA在脑中具有广泛的多巴胺能投射。前人的研究发现，如果重复刺激小脑，内侧前额叶的多巴胺水平会上升，但是这一现象在ASD小鼠疾病模型中消失了。人们认为小脑到VTA的投射是一条间接投射路线，中间要经过脑干核团。而本文的作者则探索并验证了“小脑-VTA”单突触直接投射（没有中继核团）的存在。
第1-2个步骤中规中矩，很踏实，没有难点。不过提供了一个验证神经元间单突触直接投射的完整过程，还是很值得学习的。
1. 光遗传学+顺行束路追踪
首先，他们在小鼠小脑齿状核内注射顺行荧光示踪剂AAV1-hSyn-ChR2-YFP，动物存活期至少2周，然后进行光遗传学实验，实验后灌流做切片染色。以hSyn做启动子，荧光蛋白的表达效果比用CAG做启动子的好。 AAV是一种常见病毒载体，一般认为不会跨突触感染，所以可作为所转染的细胞的直接投射示踪剂。不同的血清型在转染时有各自偏好的细胞类型。一般进行神经元示踪的时候，多用AAV2/5/9。我平时用的是AAV5-hSyn-ChR2-GFP。目前有文献报道AAV1型具有比较强的顺行跨突触感染能力。不过这篇文章后续的实验步骤已经排除了间接投射路线的可能。
由于他们用的是ChR2-YFP，所以如果在VTA区能检测到黄色荧光，且用光照射此处（即照射被感染的轴突末端的ChR2，模拟动作电位传导，释放神经递质）能在VTA神经元中记录到动作电位，就可以初步说明小脑具有到VTA的投射。
作者没有具体说是转染哪个小脑核团，只是笼统地用了DCN这个描述。从图像来看，主要是在与大脑皮层有丰富联系的齿状核，但是在间位核、顶核和皮层蚓部都有荧光。
而在VTA区所记录到的动作电位也比较合理。CN神经元有自发放电的特点，也就是就算啥也不做，它也在那里突突突突突突。作者就采用了间隔时间为0-1秒的20hz光刺激。如果VTA确实接收来自小脑的直接投射，那么它应该也具有这样连续放电（不应期短）的特点。结果符合预期。
2. TTX+4-AP验证单突触连接
作者在VTA区进行了全细胞电压钳记录。
在-70mV下，1ms光刺激后记录到突触后兴奋电位（EPSC），其衰减时间常数小，且能被AMPA受体抑制剂CQNX有效阻断。提高电位至+50mV下，能够得到第二个衰减时间常数，该电位被NMDA受体抑制剂AP5有效阻断。这说明小脑-VTA投射的突触后膜离子通道是谷氨酸能的。
接下来要验证单突触连接（monosynaptic connection）。为什么第一步里面不能说明小脑-VTA是单突触连接？因为有可能小脑先投射到VTA附近其他神经元，再与VTA联系；光刺激后可能先是中继神经元兴奋，再释放神经递质激活VTA。也就是说仍然有环路存在的可能性。
但如果我们能够阻断所有的电压门控型钠离子通道，就可以该区域中所有的动作电位。这时再进行光刺激，就可以仅打开光控型钠离子通道，也就是ChR2。此时如果能记录到动作电位，那就可以说明只有带有ChR2的神经元直接激活了目标细胞。
如图所示，作者用tetrodotoxin（TTX）作电压门控型钠离子通道阻断剂，施加光刺激，此时没有动作电位。若附加4-AP来阻断钾离子通道，以减小正离子外流的影响，就观测到了动作电位。现在就证明了小脑与VTA之间存在谷氨酸能单突触连接。
3. 免疫染色+顺行跨单级突触束路追踪
VTA内含有多巴胺能和非多巴胺能的神经元。为了检验小脑的投射是否具有选择性，作者先对之前的AAV示踪脑进行了切片染色。所使用的标记蛋白为酪氨酸羟化酶（TH），即催化多巴胺前体多巴合成的酶。由于在进行全细胞记录时，玻璃微电极内含有带Neurobiotin的溶液，可以标记出所记录的神经元，染色时便可观察neurobiotin和TH及ChR2的重合度。
在图中我们看到记录到与小脑有直接连接的VTA细胞有的含TH，有的不含。
作者进行了另一个解剖学示踪检验。这次他们用的是可以跨越突触的示踪剂。
示踪剂的分类很多。按照示踪方向来分，有顺行和逆行两种。转染后，从神经元胞体向末梢方向感染或扩散的，是顺行示踪；反之，末梢-胞体方向为逆行。这里的末梢可以是树突或轴突。有些示踪剂可以同时进行顺行逆行扩散，比如BDA和WGA。一般来说有机小分子的扩散都不会跨越突触，只能追踪单个被感染的神经元。有些病毒示踪剂可以跨突触感染，追踪1-4级通路。常见的病毒示踪剂有AAV（一般视为不跨突触传播），HSV（单纯疱疹病毒）可以跨越单个突触，原始RABV（狂犬病毒）可以跨越多个突触。AAV的需要至少2周的时间来表达其携带的荧光蛋白基因。RABV要快得多，第一级转染需至少30小时，往后每一级突触跨越只需20小时左右。一般到4级5级（存活时间120小时左右）的时候，先感染的细胞已经出现死亡了。不过要注意的是，虽然RABV很强，但它不会入侵通路上的所有细胞。也就是说有一些特定的神经元哪怕在RABV感染的通路上，也不会被感染。机制未知。另现在有RABV-Cre病毒，可以实现有条件地跨越突触。
作者将HSV-GFP打入小脑核团。动物存活时间50小时。最后通过染色在VTA区看到了TH+和TH-的两种HSV感染神经元。作者由此推出，小脑到VTA的投射不具有细胞选择性（就多巴胺能而言）。
4. 位置偏好检验通路是否与奖赏相关
与奖赏（reward）相关的实验通常采用条件性位置偏好（conditioned place preference，CPP）范式。也就是说，如果某个刺激是有奖赏性质的，那么动物会把这个刺激发生时的位置线索与刺激联系起来，产生对该位置线索的偏好。这其实也是为什么吸毒者在熟悉环境中难以戒毒并在戒毒后容易复吸的原因之一。
作者在实验箱中设置四个象限（仅在事后分析中显示）。基线测试中，小鼠对四个象限没有偏好（**无偏基线**）。随后，作者分别设置了两种条件，观察小脑核团中注射了ChR2-YFP的小鼠是否产生位置偏好：1. 小鼠每进入实验象限超过10s，就给予3s 20Hz的光刺激；2. 小鼠每次进入实验象限就给予3s 20Hz的光刺激，长时间停留无后续奖赏加成。
实验小鼠确实产生了预料之中的位置偏好。不过这里值得思考的是，我们需要设置哪些对照组？
一个是在小脑核团中注射了不带ChR2的单纯荧光示踪剂，消极对照。光刺激下，小鼠不应产生任何位置偏好。
另一个对照需要在VTA中多巴胺能神经元中表达ChR2，达到用光直接激活VTA神经元的目的，即积极对照。光刺激下，小鼠应当产生与实验组相同的位置偏好。这里，作者用的是DAT-Cre小鼠，同时VTA区注射flox-ChR2-YFP。
然后，作者加大了奖赏获得难度（鼠生艰难）。这时，他们采用了**有偏基线**的位置偏好测试。小鼠生来喜黑，所以基线测试中，在暗区域和亮区域间，它们在暗区域里待的时间更长。这时，如果在他们进入亮区域中时给予光刺激，小脑核团中带有ChR2-YFP的小鼠是否会在亮区域里停留的时间更长呢？
答案是肯定的。
5. 三箱任务检验通路是否与社会行为有关
实验箱这次被三等分了。
左箱里有一只被关在笼子里的小鼠，右箱里则只有一只空笼子。实验小鼠被放在中间箱中，可自由向两侧探索。基线下，实验小鼠还是倾向于找新朋友玩的（可能会聚头小声bb作者）。
但如果在小鼠进入空笼箱时给予光刺激，或者在它进入社交箱时给予光抑制（用ArchT抑制型光控离子通道），会削弱小鼠的社交偏好。
最后作者还做了一组GCaMP6钙荧光成像的实验。钙离子活动性增加往往意味着级联反应，意味着学习或其他复杂反应的发生。他们发现，在小鼠进入社交箱的时候，钙荧光增强，且荧光强度随其停留时间增长而增高。
实验到这里，就初步说明了小脑在一定程度上能够影响社会行为。但是具体如何是如何调制社会行为的，还有待进一步研究。个人感觉下一步可以使用ASD疾病模型鼠来重复这项研究，也许在ASD方面会有新突破。
这篇文章还是非常流畅好读的。内容新颖，逻辑也比较严密。粗略查了一下这两年研究小脑与情绪、社会行为的文章，小脑与VTA联系的文章还是比较少的。唯一的complain是，看了他们的补充材料，觉得小脑核团的注射位点太扩散，而且准确度不是很好。我做的小脑研究非常基础，所以我对这篇文章有关解剖学的部分更感兴趣一些。我非常想知道是哪个小脑核团与VTA有联系（可能都有联系，但贡献不等）。主打肢体运动的顶核（FN）和间位核（IN）和VTA有直接联系吗？如果是真的，maybe“运动使人快乐”就是具有很基础很直接的base了（如果有人知道这方面的基础研究，欢迎评论一下相关文章）。
（感觉这个课题并不值钱，不过可能健身房和体育公司很乐意赞助Lolll）
话说昨儿去练了几分钟卷腹，今天连大笑几声都很痛苦。这种厌恶性反应这么强烈，怎么会上瘾嘛？！坚持去不过是心疼钱，虽然钱也是我不情不愿地自愿交的_(:з」∠)_
参考文献：
Adamaszek, M., D’Agata, F., Ferrucci, R., Habas, C., Keulen, S., Kirkby, K. C., … Verhoeven, J. (2017). Consensus Paper: Cerebellum and Emotion. The Cerebellum, 16(2), 552–576. https://doi.org/10.1007/s12311-016-0815-8
Brownstone, R. M., Bui, T. V., & Stifani, N. (2015). Spinal circuits for motor learning. Current Opinion in Neurobiology, 33, 166–173. https://doi.org/10.1016/j.conb.2015.04.007
Beckinghausen, J., & Sillitoe, R. V. (2018). Insights into cerebellar development and connectivity. Neuroscience Letters. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2018.05.013
Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., & Khodakhah, K. (2019). Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.Science,363(6424), eaav0581.
来源：知乎 www.zhihu.com
作者：知乎用户（登录查看详情）
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